Phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật trong thực phẩm

phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật trong thực phẩm đóng vai trò vô cùng quan trọng trong việc kiểm soát an toàn thực phẩm. Hãy cùng VnTest tìm hiểu về các phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật trong thực phẩm qua bài viết này.

TẠI SAO PHẢI KIỂM SOÁT VI SINH TRONG THỰC PHẨM

Có rất nhiều vụ ngộ độc hay nhiễm bệnh gây ra bởi vi sinh vật hiện diện trong nước, thực phẩm hay mỹ phẩm. Kiểm soát vi sinh là một yêu cầu tất yếu không những đối với sản phẩm mà ngay trong quá trình sản xuất, chế biến thực phẩm, cũng cần kiểm soát các vi sinh vật gây bệnh truyền nhiễm vào thực phẩm thông qua tiếp xúc với bề mặt thiết bị…

Bộ Y tế Việt Nam quy định rõ giới hạn vi sinh vật trong thực phẩm theo quyết định số: 46/2007/QĐ-BYT. Ngoài ra QCVN 8-3:2012/BYT cũng đưa ra QCKT quốc gia đối với ô nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm.

phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật trong thực phẩm
Kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn của BYT

Qui chuẩn EC 2073/2005 của EU đưa ra các tiêu chí an toàn cho thực phẩm đối với một số vi khuẩn trong thực phẩm như Salmonella, Listeria monocytogenes, Enterobacter sakazakii, và các độc tố (Staphylocci enterotoxin…) Các tiêu chí này được áp dụng cho các sản phẩm đưa ra ngoài thị trường trong toàn thời gian sử dụng của chúng.

Tại thị trường Mỹ cũng đưa ra những qui chuẩn riêng APC/SPC cho các vi sinh vật trong thực phẩm theo chuẩn USDA FSIS, FDA…

>> Xem thêm: Dịch vụ kiểm nghiệm, thử nghiệm thực phẩm chuyên nghiệp; hỗ trợ công bố trọn gói

 

CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM

1.Phương pháp nuôi cấy

Nuôi cấy thường được xem là “tiêu chuẩn vàng” (gold standard) trong phân tích vi sinh thực phẩm. Phương pháp nuôi cấy truyền thống dựa trên khả năng tăng sinh tạo khuẩn lạc của vi khuẩn trong môi trường phòng thí nghiệm (Hình 1). Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy là nhạy, rẻ và dễ thực hiện, cung cấp thông tin về chất lượng, số lượng và cả chủng loại vi sinh vật sống hiện diện trong thực phẩm.

Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp nuôi cấy là rất tốn thời gian. Để có thể phát hiện được vi sinh thực phẩm cần phải thực hiện rất nhiều bước như tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, nuôi cấy trên môi trường chọn lọc và rồi còn phải tái xác nhận lại bằng các kiểm nghiệm sinh hóa và huyết thanh. Thông thường cần tốn khoảng 1 tuần để thực hiện toàn bộ quy trình trên và định danh được vi sinh vật.

Chưa kể, sự phân bố không đồng đều của vi sinh trong mẫu và sự hiện diện của các vi sinh bản địa có thể làm ảnh hưởng đến độ đặc hiệu và tính chính xác của quy trình nuôi cấy. Không chỉ có vậy, phương pháp nuôi cấy gặp nhiều hạn chế nếu VSV trong mẫu thực phẩm ở trạng thái tổn thương hoặc VBNC.

phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật trong thực phẩm
Phương pháp kiểm nghiệm nuôi cấy vi sinh

1.Phương pháp không nuôi cấy

Chính vì hạn chế về thời gian của phương pháp nuôi cấy, các phương pháp xét nghiệm vi sinh thực phẩm không nuôi cấy đã ra đời. Trong đó 2 nhóm phương pháp dựa trên nucleic acid và dựa trên thực khuẩn thể (bacterio phage) được đánh giá là có nhiều tiềm năng và hứa hẹn sẽ có thể thay thế phương pháp nuôi cấy truyền thống.

a) Phương pháp dựa trên nucleic acid nhắm đến việc phát hiện DNA/RNA của VSV gây bệnh. Phổ biến nhất trong nhóm này là các phương pháp sử dụng kỹ thuật PCR, ưu điểm của các phương pháp này là nhanh chóng, nhạy và đặc hiệu. Dù vậy do mục tiêu là DNA/RNA nên kết quả dương tính có thể là do xác VSV, vì vậy các nhà khoa học đã phải cải tiến kỹ thuật PCR bằng cách kết hợp sử dụng các thuốc nhuộm tế bào sống, phương pháp này được gọi là “viability PCR” (vPCR) (Hình 2).

Trong phương pháp vPCR, đầu tiên tế bào sẽ được nhuộm với ethidium monoazide (EMA) hoặc propidium monoazide (PMA). Các chất như EMA và PMA sẽ bám vào DNA, tuy nhiên chúng không thể xuyên qua lớp màng tế bào nguyên vẹn nên chỉ có thể bám vào DNA của tế bào có lớp màng không còn nguyên vẹn.

Khi được chiếu sáng, các đoạn DNA bị bám bởi EMA hoặc PMA sẽ bị tổn thương không thể phục hồi dẫn đến ức chế mạnh mẽ phản ứng PCR. Không chỉ có PCR, cả các kỹ thuật qPCR và LAMP cũng có thể sử dụng EMA hoặc PMA để phân biệt tế bào sống với tế bào chết theo nguyên lý tương tự.

Dù vậy, kỹ thuật vPCR chỉ dựa trên tính toàn vẹn của màng tế bào nên phát hiện các tế bào trạng thái tổn thương không hiệu quả (âm tính giả) và lại cho tín hiệu PCR với các tế bào đã bất hoạt (dương tính giả). Hơn nữa, trong một số giai đoạn sinh trưởng thì thành tế bào vi khuẩn cũng bị đục lỗ một cách tự nhiên nên nếu mẫu được lấy ở các giai đoạn này sẽ cho kết quả không chính xác (âm tính giả).

phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật trong thực phẩm
Quy trình xét nghiệm “Viability PCR”

Phương pháp RT-PCR cũng được đưa vào sử dụng nhằm phát hiện “tế bào sống” thông qua sự hiện diện của RNA thông tin (mRNA), mRNA là bằng chứng cho hoạt động sinh tổng hợp của tế bào. Trong kỹ thuật RT-PCR, mRNA sẽ được phiên mã ngược thành cDNA (giai đoạn RT) rồi sau đó được khuếch đại nhờ phản ứng PCR. Dù vậy, kỹ thuật RT-PCR không thật sự được ưa chuộng trong xét nghiệm vi sinh thực phẩm, một phần có thể là do mRNA dễ bị phân hủy nên dễ gây ra âm tính giả.

b) Phương pháp dựa trên bacterio phage là đề xuất cực kỳ thú vị cho xét nghiệm vi sinh thực phẩm, bởi vì phage xâm nhiễm trên vi khuẩn một cách cực kỳ đặc hiệu và hiệu quả. Không chỉ có vậy, phage chỉ xâm nhiễm trên vi khuẩn còn sống, vô tình điều này đã giải quyết hầu hết các thách thức trong xét nghiệm vi sinh thực phẩm.

2.Xét nghiệm vết tan (plaque assay): là phương pháp xét nghiệm đơn giản dựa trên khả năng ly giải tế bào vi khuẩn của phage. Trong phương pháp này mẫu sẽ được ủ với phage, sau đó sử dụng chất diệt virus (chemical virucide) hoặc xử lý bằng phương pháp vật lý để tiêu diệt toàn bộ các phage ngoại bào. Ngay trước thời điểm bùng phát, mẫu sẽ được pha loãng ở nồng độ thích hợp và nuôi cấy trải trên đĩa thạch mềm cùng với vi khuẩn chỉ thị. Vi khuẩn chỉ thị có thể là bất kỳ vi khuẩn nào, miễn là chúng sinh trưởng nhanh và có khả năng nhiễm loại phage đang sử dụng.

Đến thời điểm bùng phát, phage sẽ thoát khỏi tế bào trong mẫu và nhiễm vào các tế bào vi khuẩn chỉ thị xung quanh và sau khoảng 1 ngày ủ thì trên đĩa thạch sẽ xuất hiện những vết tan (plaque). Mỗi một vết tan được gọi là 1 PFU, chỉ số PFU/mL mẫu đại diện cho nồng độ vi khuẩn trong mẫu ban đầu (Hình 3).

Điểm mấu chốt quyết định thành công của phương pháp xét nghiệm vết tan (plaque assay) là bước tiêu diệt các phage ngoại bào, nếu bước này không được xử lý tốt sẽ dẫn đến tình trạng dương tính giả. Để khắc phục tình trạng này, sau bước xử lý bằng chất diệt virus cần thêm một bước PCR để kiểm tra sự hiện diện của phage trong dịch ngoại bào trước khi đem mẫu đi nuôi cấy trên đĩa thạch mềm. Điều này khiến quy trình vốn đã khá mất thời gian (hơn 1 ngày) càng trở nên phức tạp nên vẫn cần được nghiên cứu cải tiến nhiều hơn để có thể áp dụng rộng rãi trong phòng kiểm nghiệm.

phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật trong thực phẩm
Phương pháp xét nghiệm vết tan (plaque assay)

3.Xét nghiệm bằng qPCR/miễn dịch: là phương pháp xét nghiệm phát hiện những phage mới được tạo ra sau khi xâm nhiễm và ly giải tế bào chủ vi khuẩn.

Trong phương pháp xét nghiệm miễn dịch, mẫu sẽ được ủ với một lượng phage dưới ngưỡng phát hiện của các bộ kit miễn dịch. Sau một thời gian nhất định, đem mẫu đã ủ đi xét nghiệm miễn dịch, nếu kết quả ra dương tính chứng tỏ phage đã tăng sinh và vượt ngưỡng phát hiệt của bộ kit.

Phương pháp qPCR cũng sử dụng nguyên lý tương tự, phage bị cố định trên bề mặt vàng, silica hoặc cellulose đã biến đổi sẽ tiếp xúc với mẫu để gây nhiễm, mẫu sau khi được gây nhiễm sẽ chuyển sang môi trường nuôi cấy hoàn toàn mới để ủ tăng sinh. Sau một thời gian nhất định, dịch môi trường sẽ được thu nhận để thực hiện phản ứng qPCR phát hiện bộ gene của phage mới vừa hình thành.

Các phương pháp này có thể phát hiện phage chỉ sau một hoặc một vài chu kỳ ly giải tế bào, vì vậy rút ngắn thời gian xét nghiệm xuống còn từ 4 đến 8 giờ. Nghiên cứu cũng cho thấy phương pháp miễn dịch kém nhạy hơn so với qPCR một ít.

4.Xét nghiệm bằng enzyme – cơ chất: là phương pháp giúp phát hiện những thành phần nội bào phóng thích ra ngoài môi trường thông qua sự phát quang sinh học từ phản ứng giữa enzyme với cơ chất. Có 3 cách phổ biến để phát hiện sự ly giải tế bào:

– Phát hiện các marker nội bào có thể là adenosine-5 triphosphate, ATP, β-galactosidase.

– Phát hiện sự tăng sinh của phage dựa trên luciferase, protease, alkaline phosphatase.

– Phát hiện sự thay đổi độ dẫn điện của môi trường do các chất điện giải nội bào được phóng thích vào môi trường.

>> Xem ngay: Dịch vụ kiểm nghiệm an toàn thực phẩm

ƯU ĐIỂM KHI KIỂM NGHIỆM TẠI VNTEST

Viện VnTest sử dụng phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật trong thực phẩm với kỹ thuật hiện đại, dựa trên nền mẫu của bạn, chúng tôi sẽ đưa ra những gợi ý về các phương pháp phù hợp nhất như AOAC, ISO, FAO, SMEWW…

VnTest chuyên thực hiện các dịch vụ kiểm nghiệm với phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật trong thực phẩm chính xác, chuyên nghiệp, nhằm đánh giá tình trạng vệ sinh, tình trạng ô nhiễm, ngộ độc về mặt vi sinh như: tổng số vi sinh vật, coliform, coliform phân, E.Coli…

phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật trong thực phẩm

Phân tích thực phẩm

Tổng số vi sinh vật, E. coli, E. coli O157:H7, Coliforms, Fecal coliform, Enterobacteriaceae, Shigella, Salmonella, Vibrio cholera, Staphylococcus aureus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, Bacillus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium perfringens, tổng số nấm men, nấm mốc, Aspergillus spp, Lactobacilus acidophilus, campylobacter, Vi khuẩn sinh lactic, định danh vi khuẩn, định danh nấm men, định danh nấm mốc, Enzyme lipase, enzyme Diazta, Enzyme proteas, Độc tố S. aureaus, Độc tố gây bệnh tiêu chảy của Bacillus, khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn, khả năng diệt khuẩn, chất kháng sinh trong sữa.

Phân tích thủy sản

Phân tích virus Đốm trắng Syndrome – WSSV, virus Đầu vàng Complex-YCV, virus Taura Syndrome -TS, Hepatopancreas Parvovirus – HPV, vi khuẩn Necrotizing, Hepatopancreatitis – NHPB, vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio SPP, virus MB (Monodon type Baculoviros -MBV).

Phân tích mỹ phẩm, dược phẩm

phân tích các chỉ tiêu vi sinh chỉ thị và vi sinh gây bệnh như: tổng số vi sinh vật, Enterobacteriaceae và vi khuẩn gam âm khác, Staphylococcus, Pseudomonas aeruginosa…

Quý khách vui lòng liên hệ HOTLINE: 0965 338 523 để được tư vấn và nhận báo phí tốt nhất.

VIỆN KIỂM NGHIỆM VÀ KIỂM ĐỊNH CHẤT LƯỢNG VNTEST

HOTLINE HỖ TRỢ TƯ VẤN DỊCH VỤ KIỂM NGHIỆM TOÀN QUỐC:

Trụ sở chính tại Tp. Hà Nội: Số 7 ngách 168/21 đường Nguyễn Xiển, Phường Hạ Đình, Quận Thanh Xuân, TP. Hà Nội

Hotline: 0965.338.523; Điện thoại: 024.66.86.76.38

Email: mkt.vntest@gmail.com

Chi nhánh tại Tp. Đà Nẵng: Tầng 2, Tòa nhà VINADCO BUILDING, Số 01-03 Hồ Quý Ly, Phường Thanh Khê Tây, Quận Thanh Khê, Tp. Đà Nẵng

Hotline: 0965 338 523

Email: mkt.vntest@gmail.com

Chi nhánh tại Tp. Hồ Chí Minh: Tầng 4 số 232/1/33 đường Bình Lợi, Phường 13, Quận Bình Thạnh, TP. Hồ Chí Minh

Hotline: 0965 338 523 ;  Điện thoại: 028 6270 1386

Email: mkt.vntest@gmail.com